НЕКОТОРЫЕ РАСТВОРИМЫЕ ФАКТОРЫ И МИКРОРНК СЕКРЕТОМА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЭНДОМЕТРИЯ ПАЦИЕНТОК С ХРОНИЧЕСКИМ ЭНДОМЕТРИТОМ

В. А. Матвеева, Н. С. Чернышова, С. Н. Тамкович,
Н. В. Селедцова, Л. В. Артемьева, В. В. Морозов

Институт химической биологии
и фундаментальной медицины, Новосибирск

Аннотация. По сравнению с секретомом эндометриальных мезенхимальных стволовых клеток фертильных женщин, при развитии хронического эндометрита в секретоме культивируемых мезенхимальных стволовых клеток эндометрия обнаружено повышение уровней экспрессии экзосомальных miR-24 и miR-101 и значимое снижение уровней секреции VEGF и МСР-1.

Abstract. In women with the development of CE, an increase in the relative levels of miR-24 and miR-101 exosomes and a significant decrease in the secretion of VEGF and MCP-1 were found in the secretome of cultured endometrial mesenchymal stem cells, compared with the secretome of fertile women.

Актуальность. Хронический эндометрит (ХЭ) характеризуется постоянно протекающим воспалительным процессом, приводящим к потере функционально активного эндометрия, реагирующего на половые стероиды, что нарушает имплантацию эмбриона и может являться причиной ранних эмбриональных потерь и бесплодия [1]. Одним из подходов к восстановлению структуры и функций эндометрия считается введение продуктов секреции мезенхимальных стволовых клеток (МСК), которые свое регенеративное действие проявляют паракринно, через секрецию растворимых белковых факторов и различных видов РНКа, белков, липидов, заключенных в экзосомы [2]. В то же время профиль секреции при патологических состояниях может весьма специфично меняться [3]. Поскольку в восстановлении стромы, иммунной регуляции и ангиогенезе эндометрия важную роль играют собственные мезенхимальные стволовые клетки (эМСК), то целью работы стал сравнительный анализ микроРНК экзосом и растворимых факторов, ассоциированных с ангиогенезом и иммуносупрессией, секретомов МСК функционального слоя эндометрия пациенток с ХЭ и здоровых женщин.

Материал и методы. Образцы пайпель-биопсии функционального слоя эндометрия забирали в асептических условиях у пациенток с установленным диагнозом «хронический эндометрит» (n = 10) и здоровых женщин (n = 6), с их информированного согласия, на 7–9-й день менструального цикла. Средний возраст женщин составлял 34,2 ± 2,1 года. В анамнезе пациенток были выкидыши до 8–9 недель. В результате выделения из пайпель-образцов мононуклеарных клеток и их культивирования получены мезенхимальные стволовые клетки эндометрия (эМСК) [4]. Экзосомы выделяли из кондиционных сред эМСК 4-го пассажа методом ультрафильтрации и ультрацентрифугирования и подтверждали методом проточной цитофлуорометрии и трансмиссионной электронной микроскопии. Из экзосом выделяли общую РНК, в препаратах которой методом ОТ и ПЦР в режиме реального времени оценивали уровень экспрессии микроРНКа: miR-16, miR-24, miR-92 и miR-101 — и нормировали на miR-16. Концентрацию растворимых белковых факторов: сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF-А), хемоаттрактантного белка моноцитов 1 (МСР-1), фактора некроза опухоли α (TNF-α), интерлейкина 6 (IL-6) и интерлейкина 10 (IL-10) — в кондиционных средах эМСК определяли коммерческими наборами (Вектор-Бест, Новосибирск). Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета программ Statistica 7.0 и критерия Манна — Уитни (при р ˂ 0,5).

Результаты. В отличие от препаратов экзосом здоровых женщин, препараты экзосом пациенток с ХЭ содержали большее количество мембранных структур, только часть из которых по размеру и морфологии соответствовала экзосомам. Согласно результатам метода ОТ-ПЦР, экзосомальные miR-16, miR-24-3р, miR-92а, miR-101 секретируются всеми исследуемыми эМСК. Однако, в сравнении с эМСК здоровых женщин, при хроническом эндометрите уровни экспрессии miR-101-3p и miR-24-3p экзосом, секретируемых эМСК, повышены и статистически значимы для miR-24-3p (p = 0,014) и miR-101 p = 0,005) и недостоверны для miR-92a. По результатам иммуноферментного анализа все эМСК секретируют VEGF-A, МСР-1, IL-6, IL-10 и не секретируют TNF-α. Однако по сравнению с эМСК здоровых женщин уровень секреции VEGF-A и МСР-1 в кондиционных средах эМСК пациенток с диагнозом «хронический эндометрит» был заметно снижен. Сравнительный анализ концентрации IL-6, IL-10, VEGF, МСР-1 в кондиционных средах эМСК выявил статистически значимые отличия в норме и при патологии для VEGF (p = 0,0008) и MCP-1 (p = 0,003), не выявлено различий в уровне секреции интерлейкинов 6 и 10.

Известно, что miR-16, miR-24-3p, miR-92a-3p miR-101 ассоциированы с регуляцией ангиогенеза и иммунного ответа [5–10]. Проангиогенный белок VEGF-А и факторы воспаления IL-6, TNF-α являются положительными регуляторами ангиогенеза [8, 11]. МСР-1 помогает созреванию новых функциональных кровеносных сосудов, образует с VEGF петлю обратной положительной связи и играет основную роль в развитии воспаления [12–14].
IL-10 проявляет противоангиогенное и противовоспалительное действие [15]. МикроРНКа выполняют свою функцию, негативно регулируя свои целевые гены. Гиперэкспрессия miR-101-3p ингибирует секрецию VEGF-A [10]. Гиперэкспрессия miR-24-3p ингибирует ассоциацию пристеночных клеток с эндотелиальными клетками, способствует снижению воспаления в эндометрии, инактивируя сигнальный путь NF-ĸB/p38MAPK, что приводит к пониженной секреции МСР-1 [6, 7]. Экспрессиия miR-92a-3p снижает секрецию провоспалительных факторов TNF-α и IL-6 [8].

Повышение уровней экспрессии экзосомальных miR-101-3p и miR-24-3p и снижение уровней секреции основных проангиогенных цитокинов VEGF и MCP-1 эМСК при хроническом эндометрите свидетельствует об обратной регуляции ангиогенеза этими микроРНКа. Ингибирование секреции VEGF-A miR-101-3p, секреции MCP-1 и, возможно, миграции пристеночных клеток к эндотелиальными клетками miR-24-3p при неизменных экспрессии miR-92a-3p экзосомами эМСК и секреции IL-6, IL-10 эМСК, по-видимому, индуцирует подавление ангиогенеза и способствует формированию микроциркуляторной недостаточности в эндометрии, являющейся одной из причин «тонкого» эндометрия при хроническом эндометрите. Дисбаланс между ангиогенными индукторами и ингибиторами, вероятно, является важным фактором в патогенезе микрососудистых осложнений при ХЭ. Кроме того, повышенные уровни экспрессии при хроническом эндометрите экзосомальных miR-24-3p и miR-101 эМСК на фоне пониженной секреции МСР-1 и неизмененных уровнях секреции ИЛ-6 и ИЛ-10 могут отражать дисбаланс и в иммунном ответе, направленном на поддержание местного хронического воспаления в тканях эндометрия.

Выводы. При ХЭ регистрируется повышение относительных уровней экзосомальных miR-24 и miR-101 и значимое снижение уровней секреции растворимых белковых факторов VEGF и МСР-1 в кондиционных средах МСК эндометрия, культивируемых в стандартных условиях. На основании полученных данных можно предполагать участие сигнальных путей VEGF-А, AKT/eNOS, NF-ĸB/MAPK в развитии хронического эндометрита. Для понимания механизмов, лежащих в основе наблюдаемых эффектов, необходимы дальнейшие исследования.

Работа поддержана проектом № 1.6.12 базового бюджетного финансирования 2021–2024 гг.

Список литературы

1. Kotaro K. et al. Chronic endometritis: potential cause of infertility and obstetric and neonatal complications // Am. J. Reprod. Immun. 2016. Vol. 75. P. 13–22. DOI: 10.1111/aji.12438

2. Tabeeva G. et al. The Therapeutic Potential of Multipotent Mesenchymal Stromal Cell—Derived Extracellular Vesicles in Endometrial Regeneration // Int. J. Mol. Sci. 2023. Vol. 24. P. 9431.

3. Yuana Y., Sturk A., Nieuwland R. Extracellular Vesicles in Physiological and Pathological Conditions // Blood Rev. 2013. Vol. 27. P. 31–39.

4. Dominici M. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells: the International Society for cellular therapy position statement // Cytotherapy. 2006. Vol. 8, No. 4. P. 315–317. DOI: 10.1080/14653240600855905.

5. Yu T. et al. MiR-16-5p regulates postmenopausal osteoporosis by directly targeting VEGFA // Aging (Albany NY). Impact Journals, LLC, 2020. Vol. 12, No. 10. P. 9500.

6. Cai Z. et al. MiR-24-3p regulates the differentiation of adipose-derived stem cells toward pericytes and promotes fat grafting vascularization // FASEB J. John Wiley & Sons, Ltd, 2023. Vol. 37, No. 5. P. e22935.

7. H. Xu et al. TNF- α Enhances the Therapeutic Effects of MenSC-Derived Small Extracellular Vesicles on Inflammatory Bowel Disease through Macrophage Polarization by miR-24-3p // Stem Cells Int. Hindawi Limited, 2023. Vol. 2023.

8. Chang Y. J. et al. Extracellular miR-92a mediates endothelial cell-macrophage communication // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. NIH Public Access, 2019. Vol. 39, No. 12. P. 2492.

9. Oladejo A. O. et al. MicroRNA miR-24-3p Mediates the Negative Regulation of Lipopolysaccharide-Induced Endometrial Inflammatory Response by Targeting TNF Receptor-Associated Factor 6 (TRAF6) // J. Inflamm. Res. 2022. Vol. 15, No. 2021. P. 807–825.

10. Guo X. et al. Cancer-Associated Fibroblasts Promote Migration and Invasion of Non-Small Cell Lung Cancer Cells via miR-101-3p Mediated VEGFA Secretion and AKT/eNOS Pathway // Front. Cell Dev. Biol. Frontiers Media S. A. 2021. Vol. 9. P. 764151.

11. Haruso J., Shaughnessy J., Richardson P. Multiple myeloma Hematology // Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2004. P. 237–256.

12. Ma J. et al. MCP-1 mediates TGF-β-induced angiogenesis by stimulating the migration of vascular smooth muscle cells // Hemostasis, Thrombosis and Vascular Biology. 2006.

13 Hong K., Ryu J., Han K. Monocythemoattractant protein-1-induced angiogenesis is mediated by vascular endothelial growth factor-A. // Blood. 2005. Vol. 105 (4). P. 1405–1407.

14. Broek V. et al. The chemokine receptor CCR2 is expressed by human multiple myeloma cells and mediates migration to monocyte chemotactic proteins produced by bone marrow stromal cells MCP-1, -2 and -3 // Br. J. Cancer. 2003. Vol. 88 (6). P. 855–862.

15. Sylvester J. et al. Antiangiogenic effect of interleukin-10 on ischemia-induced angiogenesis in the hindlimb of mice // Circ. Res. 2000. Vol. 87. P. 448–552.